水蛭素对瘢痕成纤维细胞基质金属蛋白酶作用的实验研究(2)
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参见附件。
1.2 实验试剂及器械：DMEM高糖培养基(Hyclone公司)，胎牛血清(杭州四季青生物材料研究所)，磷酸盐缓冲液(PBS)(北京中杉金桥生物科技公司)，四甲基偶氮唑盐(MTT)(北京索莱宝科技有限公司)，水蛭素(武汉圣天宇科技有限公司)，MMP-2/MMP-9ELISA检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。超净工作台(苏州净化设备公司)，全自动酶标仪(美国伯乐公司)。
1.3 实验方法
1.3.1 增生性瘢痕成纤维细胞的培养：采用组织块法进行原代培养。将手术切取的瘢痕组织在无菌条件下清洗后剪成1mm3的小块，置入培养瓶中静置培养。待细胞长满平底70%时进行传代培养。本实验所用为第4～7代细胞。
1.3.2 实验分组及干预：实验按照水蛭素浓度分为四组：对照组(0U/ml)；1U/ml组；10U/ml组；50U/ml组。每组6孔，对照组每孔加入无血清DMEM培养液200ul，其余各组每孔加入含对应浓度水蛭素的DMEM培养液200ul。各浓度组又分为24h组、48h组。
1.3.3 MTT检测细胞增殖活性：加入水蛭素作用24h、48h后加入5mg/ml的MTT溶液，培养4h后加入150ul DMSO(二甲基亚砜)，酶联免疫检测仪于490nm处测量OD值，绘制细胞增殖曲线。
1.3.4 ELISA测定MMP-2,MMP-9表达水平变化：采用双抗体夹心ELISA法测定各组标本MMP-2、MMP-9的表达含量，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。用酶标仪在450nm处测定样品OD值，根据样品吸光度值计算出样品浓度。
1.4统计学分析：采用SPSS13.0软件包进行分析，数据以均数 标准差(x±s)表示，组间差异比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 增生性瘢痕成纤维细胞形态学观察：组织块培养5～7天后可见细胞从组织块周围爬出并开始贴壁生长，细胞呈梭形，胞体饱满，扁平长突起状，多呈平行排列并有一定弧度。细胞中央可见到圆形或卵圆形细胞核，细胞周围可见到2～3个突起。
2.2 水蛭素作用前后细胞形态学变化：水蛭素作用24h，倒置相差显微镜观察见HSFB呈平行极性排列，形态较规则，可见扁平而长的突起，数量开始减少。作用48h部分细胞开始变圆，细胞间隙增大，细胞数量减少明显，细胞间接触减少。
2.3 水蛭素对增生性瘢痕成纤维细胞细胞活力及增殖的影响：表1显示水蛭素对HSFB的增殖有抑制作用。随着药物浓度增加，抑制呈增加趋势，50U/ml组抑制作用最明显。
2.4 ELISA法测定水蛭素作用HSFB分泌MMP-2,MMP-9表达变化：水蛭素对增生性瘢痕成纤维细胞分泌MMP-2的影响见表2，水蛭素对增生性瘢痕成纤维细胞分泌MMP-9的影响见表3。由表2可见：水蛭素作用24h后检测到细胞中MMP-2表达水平呈增加趋势，1、10、50(U/ml)组中MMP-2的浓度均高于对照组(1765.5pg/ml)中的浓度，且1U/ml组中表达含量达最高水平(4988pg/ml)，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。而48h后MMP-2含量呈下降趋势，以10、50(U/ml)组的减少较明显，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。由表3可见：作用24h后随着药物浓度的增加MMP-9表达含量呈增加趋势，以50U/ml组含量最高(273.83pg/ml)，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。48h组MMP-9表达含量较24h组明显升高，但各浓度组与对照组比较差异无明显统计学意义(P>0.05)。
3 讨论
3.1 水蛭，俗称蚂蝗，是一味传统中药，始载于《神农本草经》谓其：水蛭味咸平，主逐恶血、瘀血、月闭,中医认为有破血、逐瘀、通经功能。1955年德国人Markwardt F[1]首次从医用水蛭中成功分离出水蛭素，1970年被证明为凝血酶的特异性抑制剂。水蛭素是目前已知的高效、特异、活性最强的凝血酶抑制剂,由65个氨基酸残基组成单链多肽，分子量约为7000，能与凝血酶直接结合，抑制凝血酶活性而产生抗凝作用。与肝素[2]相比，水蛭素抗凝活性更强，且用量少不会引起出血，也不依赖于内源性辅助因子，是一类很有应用前景的抗凝药。目前临床上广泛应用于心血管内科，肾内科，烧伤整形外科等领域。近年来研究发现水蛭素有抑制细胞增殖作用，Ogiichi T等[3]将水蛭素作用于神经胶质瘤细胞证实水蛭素能抑制神经胶质瘤细胞的增生，郑燕林[4]等将水蛭素作用于兔增殖性玻璃体视网膜病变模型后发现水蛭素能够抑制细胞增殖和细胞外基质的产生，杨影等[5]证实其对体外培养的巩膜成纤维细胞及细胞外基质有抑制作用。
3.2 增生性瘢痕是皮肤真皮损伤尤其是深度烧伤后创面修复异常所致的病理性结构，目前研究多认为是以成纤维细胞过度增殖为主的细胞外基质大量合成、降解不足及大量细胞因子产生所致[6]。基质金属蛋白酶(MMPs)是一族含有九种甚至更多的具有很高同源性的含锌或其他金属离子的内源性多肽酶。在已经了解的MMPs中MMP-2(又称明胶酶A)和MMP-9(又称明胶酶B)是胶原及基质降解的关键酶，共同的酶底物主要是IV型胶原，此外MMP-2还可以降解V、VII型胶原、弹性蛋白、纤维粘连蛋白等。MMP-2和MMP-9分布在瘢痕组织的各层，前者以成纤维细胞周围的染色最明显，与瘢痕组织早期的细胞外基质的分解代谢关系密切；后者主要表达于表皮细胞中，出现在创面愈合的早期。两者与其抑制因子关系的失衡是促进创面过度修复形成瘢痕的关键因素。瘢痕增生早期，MMP-2分泌增加促进基质分解，利于成纤维细胞、肌成纤维细胞迁移能促进创面愈合。章伏生等[7]研究发现3～6月瘢痕组织和6～12月瘢痕组织中MMP-2表达均较正常皮肤增高，而3～6月瘢痕组织的MMP-2又显著高于6～12月瘢痕组织的MMP-2，亦说明在早期瘢痕中表达更明显。随着成纤维细胞迁移、增殖，引起MMP-2等的抑制因子产生增加，超过MMP-2和MMP-9表达含量的增加，导致二者关系失衡引起细胞外基质合成分解代谢失衡，致使细胞外基质大量沉积。
3.3 本实验收集增生性瘢痕标本进行原代培养，在体外构建增生性瘢痕成纤维细胞培养模型，通过MTT测定细胞活力发现水蛭素对增生性瘢痕成纤维细胞的增殖有抑制作用，作用24h即开始抑制细胞生长。酶联免疫吸附试验发现不同浓度水蛭素作用后细胞培养上清液中MMP-2和MMP-9表达含量较对照组增加，以1U/ml浓度对二者表达含量影响作用最明显，能够促进二者表达含量的升高，说明水蛭素对MMP-2和MMP-9表达有促进作用。我们认为水蛭素对增生性瘢痕的抑制作用机制一方面可能是抑制成纤维细胞的增殖，另一方面是能够促进MMP-2和MMP-9的表达，增加酶含量促进细胞外基质的降解，因而能够减轻瘢痕增生。实验为今后进一步研究水蛭素对增生性瘢痕作用机制提供了思路。
3.4 在增生性瘢痕发生和转归过程中MMP-2，MMP-9和其抑制因子起着重要的调节作用。李璇[8]等研究发现水蛭素能够通过减少胶原产生来抑制增生性瘢痕 ......
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